Gå till föregående kapitel genom att trycka här.

Faderskapsanalys

DNA-fingerprinting är en relativt ny metod för att bestämma släktskap mellan olika individer, de första lyckade försöken på fåglar gjordes 1987. Analysen utformades av Jeffreys (Jeffreys et al 1985, Jeffreys et al 1986). Metoden har inneburit ett genombrott för forskningen kring arters häckningsbiologi och används nu av allt fler forskare. Det behövs ett bra mikrobiologilaboratorium för att kunna få bra resultat och i Sverige är det bara Lund och Uppsala som har genomfört dessa studier på fåglar. Materialet från Tåkern har analyserats vid Wallenberglaboratoriet i Lund.

Metodik

Grunder

För att kunna förstå hur analysen går till måste man kunna en del om hur DNA är uppbyggt, därför följer här en kort redovisning över grunderna inom detta område.

I cellkärnan i alla organismers celler finns det information om hur kroppen ska byggas upp. Till skillnad från däggdjuren har fåglarna kärnor även i de röda blodkropparna. Informationen finns i långa molekyler, DNA (deoxiribonukleinsyra), som styr proteinsyntesten i cellen. DNA-molekylen består av två spiraler som hålls samman av bryggor av fyra olika ämnen, sk baser, guanin (G), cytocin (C), adenin (A) och tymin (T). Basernas ordningsföljd utgör den genetiska koden. En sekvens av tre baser, t ex CCG, GAC kodar en viss aminosyra. Tillsammans utgör bassekvenserna en instruktion till hur aminosyrorna ska sättas ihop till ett visst protein. Hos fåglar innehåller varje DNA-molekyl ungefär 1 miljard baser (Ellegren 1994). DNA:t ligger ihoprullade och formar då kromosomer, av dessa finns i varje cellkärna ett bestämt antal. Vid parningen överförs lika andel kromosomer till avkomman från båda partnerna. Genom DNA-fingerprinting kan man känna igen dessa och kan jämföra ungarnas kromosomer med de misstänkta föräldrarnas.

Metoden använder sig dock inte av den del av DNA:t som lagrar information utan av de ca 90% procent som består av innehållslösa upprepningar, sk mikrosatteliter. Dessa delar innehåller sekvenser med enkla upprepningar som t ex AAAAAAAA upp till delar med hundratals enheter. Vissa av dessa delar är sk hypervariabla, dvs de varierar kraftigt mellan olika individer. De är dock lika mellan föräldrar och ungar, dvs den halvan som barnet får från respektive förälder. Att just hälften kommer från en förälder beror på att vid parningen kommer hälften av alla kromosomer från hanen och hälften från honan.

Analysmetodik

De celler som används i analysen är blodceller. Alltså tas blodprov från fåglarna vilket sker enligt följande: Med hjälp av en kanyl (Microlance 2, 0.4 mm i diameter) punkterar man en blodåder på fåglarnas vinge (se figur 12) och med ett kapillärrör (ett mkt smalt glasrör) suges sedan ungefär 50 µl blod. Blodet överförs till ett provrör med en buffert bestående av SET-lösning (0.15 M NaCl, 0.05 M TRIS, 0.001 M EDTA) som sedan fryses. Anledningen till denna behandling är att förhindra att DNA-trådarna bryts ned av naturliga reaktioner. I laboratoriet genomförds sedan följande procedurer: Först löses DNA:t ut ur cellen mha av 10 µl SDS (20%) och 13 µl Proteinase K (10 mg/ml). Detta sätts sedan i ett 55o vattenbad över natten. Sedan tillsätts i tre omgångar: fenol, fenol och kloroform, kloroform. Vid varje tillfälle renas DNA:t från proteiner och lägger sig över dessa i provröret. Det kan då sugas upp och separeras från proteinerna. DNA:t fälls sedan ut med 0.1 volymer 3 M natriumacetat och 2 volymer ren etanol, tvättas sedan med 75% etanol och torkas med vakuumcentrifugering. Sedan upprepas hela proceduren , innan DNA:t, som formats till en liten pellet, kan lösas i 50 µl TE för att förvaras till den slutliga analysen.

Figur 12: Blodprovet tas i en blodåder på undersidan av vingen. Teckning: Jonas Olsson.

Ungefär 10 µg av allt DNA löses sedan i 18-20 enheter Alu I i minst tre timmar. Alu I är ett enzym som utvinns från bakterien Arthrobacter luteus. Enzymet gör att DNA-tråden delas upp i flera små delar med olika längd. Denna lösning läggs på en 25 cm lång 0.8% agaros gel (ett poröst ämne) och sedan lägger man en spänning över gelen (37 V) mha en 0.5 * TBE buffert. Detta kallas för elektrofores och pågår i ungefär 70 timmar. DNA-delarna vandrar då genom gelen eftersom de är elektriskt laddade. Långa delar vandrar långsammare i gelen eftersom den innehåller molekyler som förhindrar deras framfart och på så vis separeras långa delar från kortare. För att kontrollera att de korta delarna vandrat tillräckligt långt, färgar man sedan in gelen med ethiumbromid och standardiserade provers position kontrolleras. Med hjälp av vakuumtork och 0.4 M NaOH överföres sedan DNA-bitarna till ett nylonfilter. Filtret behandlades med 5*SSPE, 5*Denhardt´s lösning, 0.5% SDS och Jeffrey´s probe. Den sistnämda är en radioaktiv markör som söker sig till en viss sekvens av DNA-kodning. Filtren tvättades sedan med 2*SSPE och 0.1% SDS i 30 minuter och 2*30 minuter i 1*SSPE och 0.1% SDS. Sedan används den radioaktiva markören för att överföra ett mönster på en film, denna process tar 1-7 dagar i -70o. Resultatet av alla dessa procedurer blir ett autoradiogram (se figur 13). (Bensch 1993, Ellegren 1994)

Metod för att analysera autoradiogram

Det förekommer givetvis en viss osäkerhet vid denna typ av undersökningar. Trots att sannolikheten att två fåglars autoradiogram ska vara lika är en på 10 miljoner, så finns det andra problem att räkna in. Enäggstvillingar får t ex samma mönster, detta gör att de inte går att skilja åt. Ett annat problem är mutationer, dvs förändringar i DNA-koden. Dessa är förvisso ovanliga men kan, när de finns, göra att vissa streck på autoradiogrammet inte stämmer med föräldern. Men man kan lätt komma runt problemet genom att när man analyserar autoradiogrammen kräva att flera band ska vara olika för att utesluta en misstänkt förälder.

Det intervall som används för att analysera autoradiogrammen är ungefär mellan 3.0 till 23 kb (b=antal baspar). För att två band ska anses vara samma får de inte skilja sig mer än 0.5 mm.

Resultat

Analyserna pågår för tillfället i Lund och följdaktligen finns inga färdiga resultat. Förhoppningsvis kommer dessa till sommaren 1994.

Har ej ordnat tillstånd att publicera denna bild än Figur 13: Ett exempel på autoradiogram. Detta är från två trastsångarkullar från Kvismaren där alla ungar visade sig till höra de respektive misstänkta fadrarna (M1, M2). Honan betecknas med F och ungarna med C och D. (ur Bensch 1993)

Gå till nästa kapitel genom att trycka här.

This page has been accessed

RXML parse error: This tag doesn't handle content.
 | <accessed>
 | <spider>